核糖测序讲座视频笔记

系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
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1、核糖体ribosome

参考https://www.nature.com/scitable/topicpage/ribosomes-transcription-and-translation-14120660/

• 简单来说，核糖体是mRNA翻译蛋白质的场所；

  
  
  

  中心法则
  
  

  其中翻译遵循的规律是mRNA单链上每三个核苷酸称之为一个密码子，对应一种氨基酸。

  
  
  

  image from wiki

• 大致翻译步骤（参考下图）
  (1) 当核糖体接触、识别到mRNA的启动子（AUG），翻译开始；
  (2) tRNA将对应氨基酸运到密码子附近；
  (3, 4, and 5) 氨基酸结合，tRNA位移，往复循环；
  (6) 当遇到终止密码子时，翻译结束。核糖体脱落，并形成一条肽链。

  
  
  

  image form https://www.nature.com/

• 关于核糖体主要由rRNA与蛋白质组成，通常认为是由两个亚基结构。翻译时把mRNA“夹在中间”

  
  
  

  ribosome 'sandwich' when translation

特殊的几种翻译情况

• 非编码RNA（lncRNA）
  （1）70%DNA可转录RNA；3%DNA转录可编码的mRNA；
  （2）不翻译的原因有很多例如无法出细胞核、无法接触翻译机器....
• 部分翻译
  一般指从非AUG启动子区域开始翻译
• 过度翻译
  一般指circRNA的情况，蛋白氨基酸数量远大于对应原始编码链长度

2、ribo-seq

• 指ribosome-seq，于2009年在science发表，是翻译组学的一种方法；
• 对在某一时刻下，捕捉到所有核糖体正在翻译的，所结合的mRNA序列（片段）；

2.1 实验步骤

主要参考2009年在science文献，之后的方法也大同小异

• （1） robustly generate ribosome-protected mRNA fragments (“footprints”) whose sequences indicate the position of active ribosomes;
  这一步是ribo-seq的关键，通过添加翻译抑制剂，使核糖体停止翻译，并在该状态下“绑”在mRNA上；然后对mRNA降解消化，核糖体mRNA符合物受到保护而“富集”。

如下图，ribo-seq的关键就是产生ribosome-protected mRNA fragments(RPFs)。图右是常规RNA-seq测序的input对照

first step

• （2）convert these RNA footprints into a library of DNA molecules in a form that is suitable for deep sequencing with minimal distortion;
  简单来说就是将RPFs制备DNA测序文库；

  
  
  

  second step
• （3）measure the abundance of different footprints in this library by means of deep sequencing.
  最后进行二代测序

2.2 数据特征

• 由于ribo-seq相当于是核糖体捕捉的mRNA片段测序，所以测序比对结果上有许多不同于传统RNA-seq之处

（1）read length distribution

• 大部分的RPFs长度集中在28~30nt长度
  如下图上下为核糖体的60S、40S亚基，中间代表处于核糖体内被保护的mRNA序列。

  
  
  

  image.png

• 在线粒体与叶绿体中翻译的RPFs长度分布略有不同。

  
  
  

  image.png

（2）read located annotation

• 大部分RPFs还是位于CDS区；

  
  
  

  image.png

• 还有相当一部分处于5'-UTR区。这与观察的RPFs片段5'端核苷酸分布是一致的。
  即如下图5′ ends of the footprint fragments started abruptly 12 to 13 nt upstream of the start codon, ended 18 nt upstream from the stop codon.
  原因不难理解，可参看上面第三张图（40s、60s），即核糖体内翻译密码子的位置是固定的（P site、A site）

  
  
  

  image.png

（3）三密码子周期性

• 对于任意一个密码子，frame 0/1/2分别代表5'→3'的三个核苷酸

• 而从RPFs片段5'端第一个碱基的分布可以看出明显的3nt周期性。

  
  
  

  image.png

• 即大部分是落在每个密码子的frame0位置；而反映在分布图中，则是每三个位置出现一个峰，也进一步验证了三核苷酸密码子的翻译准则。

  
  
  

  image.png

2.3 应用范围

• 上面2.2只是初步展示了ribo-seq的数据特征，还有很多更深入的探索，例如ORF有关的Translation Efficiency (TE)计算等，可以参看相关ribo-seq应用文献。

• Ribo-seq的应用范围，如下图可涵盖四个方面
  （1）应用于翻译探究机制
  （2）深化转录组分析
  （3）用于解释转录组与蛋白组结果的不一致
  （4）可以深化非编码RNA的测序分析

  
  
  

  image from 达澈生物

最后推荐两篇文献，一篇是2009年第一次提出ribo-seq；另一篇是2017年对于riboseq的综述；笔记中的例图基本都来自这两篇文献。

• Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling
• Beyond Read-Counts:Ribo-seq Data Analysis to Understand the Functions of the Transcriptome
  需要这两篇文献的朋友可以在评论区留言邮箱，我看到后会发给大家的。