细胞复苏、体液交换、输血、冷冻protocol - 细胞输血

细胞传代是指将细胞培养物分出来，重新接种到新的培养瓶/皿内，使细胞重新获得足够的生长空间的过程。

对单层生长的贴壁细胞而言，当细胞汇合度为 80%左右时，细胞状态是最好的，此时适合进行传代。

1、 准备工作：

预热完全培养基、DPBS、胰蛋白酶或其他可解离细胞的试剂，酒精棉擦拭瓶外表面后移入生物安全柜/超净工作台。

细胞培养箱中取出的细胞，酒精棉擦拭培养瓶/皿外表面，移入生物安全柜/超净工作台。可以稍等待，待生物安全柜中的循环风将试剂瓶和培养瓶的外表面吹拂几分钟后，拧开试剂瓶盖虚掩，拧开培养瓶瓶盖虚掩，培养皿盖不用拧。

2、 细胞消化：

吸去旧的培养基，DPBS 洗细胞 1-2 次，加入消化液（胰蛋白酶或含 EDTA 的胰蛋白酶或无动物成分来源的 TryplLE），轻轻晃动培养瓶/皿，使消化液能均匀布满所有细胞。

一些强贴壁的细胞，如果使用胰蛋白酶消化，可以用胰蛋白酶代替 DPBS 清洗细胞，并在 37℃进行消化（加上消化液后放进 37℃细胞培养箱）。

用含EDTA 的胰蛋白酶来消化细胞的话，消化速度会更快。

强贴壁细胞或用特殊的无血清培养基培养的细胞使用 TrypLE 消化。

细胞消化的同时可以准备新的培养瓶/皿，往培养瓶/皿中添加适量新鲜培养基。

3、 终止消化：

当镜下观察贴壁细胞直接的连接松散，细胞有所变形，但还没有出现大片脱落时，吸去消化液，稍待一两分钟，让残留在细胞表面但是肉眼看不见的消化液进一步消化。

加入适量完全培养基，轻柔吹打细胞（用一层层“扫描”方式来吹打），不要忘了沿边“清扫”。胰蛋白酶可以被完全培养基中含的血清终止。

EDTA 无法被终止，因此含 EDTA 的胰蛋白酶消化的细胞，可以在加完全培养基吹打之前用DPBS 洗 1-2 遍。

TrypLE 无需终止，DPBS 稀释即可，因此也可以在加完全培养基吹打之前用 DPBS 洗 1-2 遍。

最好控制不要消化过度，细胞成片脱落。当细胞消化过度时，只能通过离心去除消化液了。

吹打细胞时注意轻柔，控制泡沫，以免对细胞造成太多的细胞损伤。吸不净，吹不净， 枪尖始终保持在液体中可以有效控制泡沫产生。

4、 接种细胞：

在加入新培养基吹打细胞时即可规划好，打算一盘细胞分成 N 盘，那就用 0.5N/1N ml 培养基进行细胞吹打。

将细胞吹打成细胞悬液后即可每个新瓶/皿接种 0.5 或 1ml，十字混匀后，送入细胞培养箱继续培养。

通常细胞可以 1:2、1:3、1:4 传。有些细胞不能传太稀，容易状态不好生长缓慢。

对悬浮细胞而言，因为不需要消化，传代过程比较简单，直接吸取一定量旧培养物接种到新培养瓶/皿即可。