论文-41 与红掌植物不同组织相关的微生物群落 (微生物与环境, 2016 ) 2021-01-27

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原文：Bacterial Communities Associated with Different Anthurium andraeanum L. Plant Tissues
作者： Yohanna Sarria-Guzmán
作者单位： CONACYT-Colegio de Postgraduados Campus Campeche, Champotón, Campeche, 24450, Mexico
doi: 10.1264/jsme2.ME16099

摘要：

与植物相关的微生物具有特定的有益功能，被认为是植物健康的关键驱动力。通过与植物不同部位和根际相关的16S rRNA基因焦磷酸测序研究了健康的红掌植物的细菌群落结构。有限的细菌类群，即中华根瘤菌，Fimbriimonadales和γ变形杆菌HTCC2089富集于A. Andraeanum根际中。根中的内生植物比芽中的多样，而所有芽的内生植物都在根中。仅在茎中发现了链霉菌，琥珀酸杆菌和星形胶质体，仅在茎中发现了Variovorax paradoxus，在茎秆中仅发现了Fimbriimonas 97％-OTU（即被认为是特异性菌株），而Brevibacillus, Lachnospiraceae, Pseudomonas, and Pseudomonas pseudoalcaligenes 定殖了所有植物部分 。厌氧的重氮细菌Lachnospiraceae, Clostridium sp., and Clostridium bifermentans 细菌定居在芽系统中。在根际和基质（土壤，牛粪和泥炭的等比例混合物）中检出了属于假单胞菌的表型，并占据了内球。假单胞菌包括9种97％-OTU，它们具有不同的分布模式和不同物种的系统发生关系。假拟青假单胞菌和恶臭假单胞菌（P. pseudoalcaligenes，P. putida）占主导地位，但在根和根际也存在。荧光假单胞菌存在于所有植物部分中，而仅在基质和根际中检出了树脂假单胞菌，反硝化假单胞菌，铜绿假单胞菌和斯图氏假单胞菌。通常认为植物相关细菌群落的组成适合作为植物健康的指标。

关键词：内生菌，内球，植物-微生物协会，植物微生物组，根际微生物组。

微生物定植在植物表面或外层中，并生活在植物或内层中（36）。根-土壤界面或根际是外层土壤中经过充分研究的部分，空气-植物界面和叶际层也是如此（25，32）；但是，尚未对植物组织进行详细检查。特定的生物和非生物条件以及植物微环境中化学决定因素的作用会针对不同的微生物种群进行选择（24、36）。反过来，它们在宿主中具有特定的功能，例如抑制疾病，防止病原体感染，促进生长和促进抗逆性，同时增加营养素的动员，运输和吸收（1、9， 22）。因此，必须将植物相关微生物视为植物健康和生长的主要驱动力。根际有利于周围土壤中各种微生物的某些微生物（20）。 植物来源的分泌物和底物为根际微生物提供了养分和根系系统的物理生态位（14），而偏爱的微生物可能有助于植物的发育。虽然深层土壤特性无疑是微生物根际组成的关键决定因素，但研究表明，植物基因型也影响这些群落的整体组成（1、2、11）。
尽管通常将定植在植物组织中的微生物称为内生菌，但内球体可分为内生菌根（根），无眼圈（花），精子圈（种子）和大孢子圈（果实）（38）。细菌内生菌在健康的植物组织中定植，没有任何疾病症状。内在化可能是由被动过程引起的，例如通过自然开口（气孔和葫芦科），由昆虫和线虫引起的组织伤口，根裂和发芽的胚根，或者通过主动过程例如产生细胞壁降解酶而引起的（47）。内生细菌群落由植物特征（例如物种，品种，年龄，健康和发育阶段）以及多种非生物因素（例如土壤特性，营养状况和气候条件）定义（11）。根据细菌培养研究的发现（已通过高通量测序证实），大多数已知细菌内生菌群属于变形杆菌（38）。
尽管植物微生物区系定义了微生物多样性，这对于植物的生长很重要，但是尚未对许多经济上重要的植物（如农作物，观赏植物或药用植物及其亲属）的相关细菌群落进行研究。 Mueller和Sachs（26）提出，可以移植“健康的微生物组”以避免或治疗肠道疾病，这与肠道微生物组的发现是同义的。因此，需要更多基础和实践研究来解决导致健康植物内外的社区组装和功能的过程。
在本研究中，我们调查了经济上重要的热带花卉A. andraeanum L.的微生物组（19）。我们的目标是：i）描述和比较基质（土壤，牛粪和泥炭的等比例混合物），根际和红曲霉不同部位（即根，茎，叶，茎秆和茎线虫，在受控条件下种植，和ii）鉴定通才，即A. andraeanum所有内部组织的定植者，或专长，即特定植物器官的定植者。

材料和方法

植物材料

A. andraeanum L. cultivar Sonate的幼苗从位于墨西哥恰帕斯州Ocozocoautla de Espinoza市的商业农场“Corazónde Meyapac”获得（北纬16°46′46.90″；西经93°20′29.84″）。将植物种植在40升塑料袋中，该塑料袋包含15至20千克底物，即土壤，牛粪堆肥和酸性泥炭（pH = 4.85和EC [电解电导率] = 120 dS m-1）的等比例混合物，并隔开排之间的距离为1 m，排之间的袋之间的距离为0.3 m。蒸散量高且排水系数为25％，因此每天要用水。在6至3的发育阶段收获带有茎秆¾成熟（8）的植物，置于冰上，并运输到实验室。

DNA提取和PCR扩增

从五个重复样品中分离出内生，根际和底物细菌DNA，每个样品由三株植物组成。首先用自来水然后用无菌蒸馏水洗涤来自根，茎，叶，茎秆和茎秆的组织。通过依次浸泡在70％（v / v）的乙醇中5分钟，2.5％（v / v）的商业漂白剂5分钟（根部15分钟）对组织进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗四次。确认没有消毒和消除附生细菌，没有使用最终洗涤的水作为模板扩增16S rRNA和18S rRNA基因。将液氮施用于2 g植物组织，并用无菌研钵研磨。将磨碎的组织添加到15 mL丙烯试管和2 mL 10 mM Tris-HCl（pH 8）中，再加入160μL10 mg mL-1溶菌酶。将混合物在37℃下保持1小时。用2mL 10％（w / v）的十二烷基硫酸钠（SDS）裂解细胞。加入无菌玻璃珠并在涡旋中混合10分钟。如Navarro Noya等人所述，去除蛋白质并沉淀DNA。（27）。用三种不同的方法提取底物（1.5 g）和根际DNA（1.5 g牢固地附着在根上的土壤）。每种提取技术均使用0.5 g底物和根际的子样品，并如前所述（31）合并。第一种技术包括细菌细胞壁的酶消化，第二种是化学方法（用十二烷基硫酸钠）和细胞的物理破裂，第三种是化学方法（用Triton X-100）和细胞的物理破裂（ 31）。
引物8-F和556-R用于扩增16S rRNA细菌基因的可变区V1-V3。如Navarro-Noya等人所述进行PCR混合物和热循环。（27）。按照制造商的建议（Zymo Research，Irvine，CA，USA），将所有样品一式三份扩增，以相同的浓度合并，并使用DNA清洁和浓缩仪纯化试剂盒进行纯化。使用PicoGreen dsDNA分析（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）和NanoDrop 3300荧光光谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）对PCR产物进行定量。扩增子文库由Macrogen DNA测序服务公司（韩国首尔）使用Roche GS-FLX Titanium 454焦磷酸测序仪（Roche，曼海姆，德国）进行测序。

生物信息学和统计分析

序列通过QIIME焦磷酸测序管道（http://www.qiime.org/）（3）处理。去除了低质量的序列，并使用Denoiser（33）消除了序列中的噪音。筛选后的序列用于在Uclust相似性阈值为97％（97％-OTU）的情况下，使用Uclust通过开放参考聚类确定操作分类单位（OTU）（10）。使用RDP分类器2.2以80％置信度阈值（48）进行分类分配，并基于Greengenes参考数据库（版本1210），每个97％-OTU都有一个代表性序列。消除了来自植物的叶绿体的属于16S rRNA的序列。在QIIME（3）中计算了多样性和物种丰富度估计量。用一般线性模型程序（GLM，39）计算出α-多样性参数和细菌群的丰度之间的显着差异。
使用PyNAST，将具有代表性的97％-OTUs序列与可在http://greengenes.lbl.gov/获得的Greengenes core-set-aligned进行比对，最低序列同一性为75％（4）。使用FastTree 2.1.3（29）用比对的序列构建最大似然系统树。使用系统发育信息和出现数据来生成UniFrac距离矩阵，以比较与内部安德拉曲霉组织（内层），根际相关的细菌群落，并在基质中发现。使用UniFrac距离矩阵进行多变量分析，即主坐标分析（PCoA），以检查和可视化红球菌内圈，根际和基质中细菌群落的差异。使用UniFrac成对距离进行变异多元方差分析（perMANOVA），以测试细菌群落之间的显着差异（n = 999）。使用常规线性模型程序（GLM，39），基于最小显着性差异，使用方差分析（ANOVA）计算出由于不同处理而导致的生物分类群数量的显着差异。将属于这五个重复的序列组合起来，以图解其在红壤曲霉，根际和基质内部组织中的细菌分布和97％-OTU水平。

数据可访问性

将35个焦磷酸测序衍生的16S rRNA基因序列数据集以BioProject登录号PRJNA315163提交给NCBI序列读取档案（SRA）。

结果

红曲菌的细菌多样性和微环境组成细菌群落分析中总共包含13,160个去噪和高质量序列，检测到2,517个OTU，其相似性阈值为97％（OTU为97％）（表S1）。根际和底物中的物种丰富度和多样性高于植物（图1A）。基质和根际之间的多样性和丰富度没有显着差异，但后者比前者的差异更大（表1）。

图1

与红掌植物的根际和内球相关的细菌群落和底物，即土壤，堆肥和酸性泥炭的混合物。细菌多样性（系统发育多样性，香农和辛普森指数）和物种丰富度（观察到的97％-OTU和Chao1丰富度估计值）的框线图（A），细菌菌群的相对丰度和4种变形杆菌（条形图表示标准差n = 5）（B），以及细菌群落UniFrac距离的主坐标分析（C）。

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表格1

* 红掌基质，根际和内球及组织内部细菌的丰富度和群落多样性的比较

aSimpson：Simpson多样性指数，Shannon：Shannon-Weaver多样性指数，OTU：定义为与UCLUST相似度为97％的运营生物分类单位，Chao1：偏差校正Chao1。bMSD：最小显着差异。

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在内球中检测到9种不同的门，在底物和根际中检测到26种（图1B）。内球体中，变形杆菌（39.8％，主要是γ-变形杆菌），硬毛菌（26.9％）和放线菌（2.9％）占主导地位。根际中，细菌以细菌为主要成分（25.3％，主要是丙酸杆菌），酸杆菌（11.8％）和绿屈菌（6.4％），而细菌菌（24.5％，主要以丙酸杆菌），酸杆菌（14.4％）和放线菌（5.2％）为根。

UniFrac距离的PCoA表明，植物内部的细菌群落不同于根际和基质中的细菌群落（perMANOVA 999，拟F：3.4374，P值：0.001）（图1C）。尽管根际土壤中华根瘤菌，Fimbriimonadales和γ变形杆菌HTCC2089的相对丰度明显高于基质，但根际和基质的细菌群落没有显着差异（perMANOVA 999，假F：0.4725，P值：1.00）（表2）。

表2

红掌根际细菌菌群明显富集（P <0.05）
a MSD：P <0.05时的最小显着差异

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在基质和植物中发现根瘤菌的表型，但在根际中没有。属于碱性杆菌，Xanthomonas和Asteroleplasma的菌型仅在内球中发现（表S2）。根际特有黄素杆菌，加替利纳，盐杆菌科和嗜热芽孢杆菌，而底物中仅发现了念珠菌，杆状杆菌，尿杆菌和弯曲杆菌。在底物，根际和植物中发现了微细菌，链霉菌，黄杆菌，中华根瘤菌，缓生根瘤菌，偶氮菌，盐单胞菌和假单胞菌。

安德拉曲霉组织内生菌群落的细菌多样性

在Andraeanum的茎，叶，茎秆，茎秆和根中发现了33个细菌科（图2，表S3）。科的丰富程度依次为根（29科）> spa（16）>茎（13）>茎秆（12）>叶（10），其中假单胞菌科是植物内最丰富的科。

图2

与健康红掌植物根，茎，叶，茎和茎秆相关的细菌内生科的相对丰度。

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图3

示出了在红掌中最丰富的内生97％-OTU的分布。在所有植物部分中发现的97％-OTU属于短杆菌属，乳酸杆菌科，假单胞菌属和假拟生假单胞菌。在根部检测到的大多数97％-OTU都在植物的地上部分发现，除了OTU_4450534（梭状芽孢杆菌和梭菌），OTU_297390（双歧杆菌和链霉菌科），OTU_528577（Variovorax paradoxus）和OTU_4441357（Stenotrophomona）。仅在根中发现了OTU_1350（链霉菌），OTU_1619（食藻科），OTU_1058276（琥珀黄杆菌）和OTU_378（星状浆体），仅在茎中发现了OTU_528577（V. paradoxus），仅在根中发现了OTU_3900307（Fimbrithenas）。表S4显示了在A. andraeanum的内部组织和根际中检测到的所有属的相对丰度。

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假单胞菌科的分布

假单胞菌科是最丰富的内生细菌家族，有9个97％-OTU。它们与荧光假单胞菌，假拟拟假单胞菌，树脂假单胞菌，恶臭假单胞菌，林氏假单胞菌，反硝化假单胞菌，铜绿假单胞菌和斯图氏假单胞菌有关（图4）。 P. resinovorans，P。aeruginosa，P。denitrificans和P. stutzeri仅在基质和根际中发现，而P.fluorescens仅在内球中发现。在根际和基质中也发现了植物内最丰富的97％-OTU，即假拟青假单胞菌和恶臭假单胞菌。

图4

基于16S rRNA部分基因序列的邻居加入系统树，显示在97％截止（97％-OTU）的操作分类单位与假单胞菌数据库的序列之间的关系。括号中的数字是GenBank登录号。比例尺指示每个位点中的核苷酸取代。葡萄固氮菌（NR102817）为外群。饼形图表示在健康的红掌植物，根际和基质（即土壤，堆肥和酸性泥炭的混合物）的不同组织中观察到的97％-OTU的比例。替代=底物; 根茎=根际。

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讨论

植物与微生物不断接触，其中一些微生物能够在植物中定居并生存（32）。越来越多的研究表明，与植物相关的微生物有助于宿主的健康并增强其对生物和非生物胁迫的抵抗力（2）。最近提出的一项技术，即宿主介导的微生物组选择，已建议选择人工微生物组以提高植物的适应性（26）。但是，这项新技术需要对植物生理学以及与健康植物相关的微生物群落有更好的了解。在本研究中，我们描述了健康的A. andraeanum植物的根际和内生群落，并研究了植物内生细菌的分布模式，无论是专业的还是通才的。
内圈是一种特殊的栖息地，内生菌必须与植物成功相互作用才能生存（1）；因此，植物中的细菌多样性要低于基质或根际中的细菌多样性（图1A）。此外，内生菌通过诱导植物防御机制（即诱导的系统抗性（ISR））减少了包括病原体在内的其他微生物的进入（17）。
根际相关微生物起源于周围的基质，通常直接或间接地参与植物的生长促进（20）。影响根相关细菌群落的两个主要因素是土壤和植物特性（2）。有限数量的细菌类群富集于红曲菌的根际中，即中华根瘤菌，Fimbriimonadales和γ-变形杆菌的高通量培养物收集（HTCC）进化枝2089（表2）。根瘤菌以其与豆科植物共生关系固定大气中的氮的能力而闻名，但它也增加了枝条和根的生物量（12）。丙种变形细菌HTCC2089的成员是海洋贫营养细菌（6），与珊瑚和海绵有关（7）。尽管很难推测为什么它们在根际中比在基质中含量更高，但是植物吸收的养分可能会形成贫营养的微生境，有利于HTCC2089菌株。
根内生菌的多样性比在地上部分的多，而且几乎所有根内生菌也都在芽中被发现（图3）。通过根部裂纹的进入是细菌定殖的主要门户（38）。细菌分类群在不同器官内表现出不同的分布模式。在所有植物部位都发现了短杆菌。几项研究鉴定短杆菌属为紫花苜蓿（Medicago sativa L.），香蕉（Musa sp。L.）和藏红花（Crocus sativus L.）的内生菌（41、43、46）。属于该属的植物型具有通过生产铁载体和吲哚3乙酸并固定氮来促进植物生长的能力（13、28）。它们表现出ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶活性，并促进了丛枝菌根协会（28，35）。
链霉菌97％-OTU仅在红曲菌的根中检测到。链霉菌含有众所周知的内生菌种，通常从不同的农作物和药用或木本植物中分离出来（18、40）。它们作为内生菌的生态位主要是作为生物控制剂，可产生抑制其他微生物的抗菌物质（15）。它们具有作为生物活性次生代谢物（例如抗微生物剂）的重要来源的生物技术潜力（44）。在根部内也发现了严格的厌氧厌氧菌质-无浆菌（厌氧菌科，厌氧菌科，Mollicutes）。假定它们源自含有33％堆肥牛粪的底物，因为在绵羊和牛瘤胃中都发现了厌氧菌（49）。在牛粪堆肥和ver堆肥的早期发现了粪便（34）。
发现厌氧细菌，如Lachnospiraceae，Clostridium（Clostridiaceae）和Clostridium bifermentans（Pestostreptococaceae）定植在所有芽部位，金属丙酸梭菌（C. metallolevans）（Pestostreptococaceae）和韦氏梭菌（C. venationis）（Pestostrepthecocacea）以及在所有组织中均发现了OTU4420272鞭毛纲科（图3）。这些类群的固氮菌株已在禾本科，豆科，Poly科，根科，茄科和马鞭草科的几种物种中分离和/或检测到（23、24、37）。这项研究证实了内生梭菌的广泛分布。梭状芽胞杆菌是孢子形成，是主要的纤维素分解/果胶分解和发酵细菌群之一（5、45）。此外，Minamisawa等。（23）认为，由于细菌活性或植物呼吸作用，植物性梭状芽胞杆菌在缺氧微区中增殖，而当氧气浓度较高时，它们作为孢子存活。
在所研究的三个微环境（即内球，根际和基质）中发现了九个假单胞菌的97％-OTU，并在所有器官的组织中占主导地位。假单胞菌与芽孢杆菌一起被认为是研究植物与微生物相互作用的模型（30）。假单胞菌对植物的重要性在不同的研究中得到了证实，即依赖于培养物，分子指纹方法和宏基因组学（22）。分析了属于假单胞菌的9个97％-OTU的系统发育，并出现了不同的分布模式（图4）。与假拟青假单胞菌相关的97％-OTU 5694和与恶臭假单胞菌相关的97％-OTU 21540在安德拉曲霉的地上部分占主导地位，但在根和根际也存在（图4）。 97％-OTUs 59892、63117、40827和71431分别与树脂假单胞菌，反硝化假单胞菌，铜绿假单胞菌和斯图氏假单胞菌在系统发育上相关，并且仅从基质和根际中检索到。在整个植物中发现了与荧光假单胞菌相关的97％-OTUs 53936，而在芽组织中占主导地位的是两种假拟假丝酵母和恶臭假单胞菌。植物与假单胞菌的相互作用很复杂，因为该属的菌株具有通用的代谢能力并占据不同的生态位。一方面，某些菌株通过产生抗微生物药或分泌信号分子（例如脂蛋白，苯并-1-羧酸和2,4-DAPG）来产生植物生长促进剂并抑制多种植物病原体（20、30， 50）。另一方面，丁香假单胞菌的几种菌株是众所周知的导致严重经济损失的植物病原体或致病菌。假单胞菌还含有与人类疾病相关的土壤或根际传播物种，以及许多其他机会病原体物种（21）。在安德拉曲霉中未检测到具有植物致病性历史的假单胞菌属物种。假单胞菌97％-OTU的相关分布方式的不同可能是由于1）根际和植物组织中营养丰富的环境所产生的竞争激烈的生态位，或2）假单胞菌物种内不同的遗传同质性和异质性。例如，基于全基因组和核心基因组分析对> 1,000个假单胞菌基因组进行比较，发现铜绿假单胞菌基因组是与其他假单胞菌物种不同的同质簇，而荧光假单胞菌的基因组高度多样且具有异质性（16，42）。

结论

A. andraeanum的不同部分具有不同的内生群落，在根中发现的多样性最大。细菌内生菌的主要入口似乎是根，因为在上述地上部分发现的大多数内生菌也是在根中发现的。几个假单胞菌属。被鉴定并显示出不同的分布模式，在红掌内，根际和基质中。我们建议健康植物中发现的细菌适合作为植物健康的指标。

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