???? scRNA-seq | 单细胞教程（从原理到代码实践）（一）
1写在前面
炙手可热的单细胞测序（scRNA-seq）大家肯定都或多或少听过一些，从今天开始陆续分享我的学习笔记，有不对的地方大家多指正~????
在开始前我们先思考几个问题，如下：????
Q1: 什么是
scRNA-seq，它与bulk RNA-seq相比如何？ Q2:scRNA-seq有哪些典型应用？ Q3:scRNA-seq如何准备样品？
2什么是scRNA-seq？
2.1 什么是bulk RNA-seq
要搞懂什么是scRNA-seq，我们先了解一下bulk RNA-seq。????
RNA-seq用于由细胞混合物组成的样本中，称为bulk RNA-seq，常用于研究control/diseased、wild-type/mutant之间的转录组差异。
然而，使用bulk RNA-seq，我们只能估计每个基因在细胞群中的平均表达水平☹️，没有考虑该样本中单个细胞基因表达的异质性。
举个栗子????，早期发育研究或大脑等复杂组织。
2.2 scRNA-seq横空出世
为了解决异质性的问题，2009年首次报道了单细胞水平的RNA-seq，即scRNA-seq，
与bulk RNA-seq不同的是，使用scRNA-seq可以评估每个基因在不同细胞群中的表达水平分布。????
成功解决了转录组中细胞特异性变化的问题。可以发现新的或稀有的细胞类型，识别control/diseased组织之间的差异细胞组成或了解发育过程中的细胞分化。
2.3 scRNA-seq图谱
目前有很多的scRNA-seq图谱，全面解析了不同物种中的细胞类型。举几个栗子????，如下：
Human Cell Atlas (H. sapiens)Tabula Muris (M. musculus)Fly Cell Atlas (D. melanogaster)Cell Atlas of Worm (C. elegans)Arabidopsis Root Atlas (A. thaliana)
随着技术的进步，scRNA-seq方法学层出不穷，自首次报道后的技术发展，我们可以看到随着技术的进步，scRNA-seq可以检测到更多的细胞。
但需要说明一下，不同的技术各有其优缺点，还是老观点，新技术不一定是最好，选适合你的就行了。????
3scRNA-seq的样品制备
3.1 经典protocol
通常来说，经典的scRNA-seq的protocol可以分为以下几个步骤：
- 从组织和细胞培养中制备细胞悬浮。
- 细胞筛选（基于表面marker、转基因技术、染色等）。（可选步骤????）
- 捕获单个细胞（如
wells，oil droplets)。 - 从每个细胞中提取RNA。
- 将RNA反转录为cDNA。
- 扩增cDNA（体外转录或 PCR）。
- 准备测序文库，
adapters。 - 测序。
- 处理
raw data以获得细胞基因的count矩阵。 - 进行下游分析。
3.2 制备样品困难怎么办？
在难以分离细胞的组织中或在冷冻组织样本中，可能较难实现单细胞的制备，我们可以选择制备单个细胞核样本。
Note! 但需要注意一下，核RNA通常含有较高比例的未加工unprocessed RNA,，会测序到大量含有introns的转录本。????
具体的解决方案，我们后面再介绍吧。????
3.3 常用protocol的对比
这里我们比较一下目前常用的protocol，这里不包括Smart-seq3和Smart-seq3xpress，后面我们单独介绍这两种方法。
4细胞捕获
目前应用最广泛的三种方法为microtitre-plate, microfluidic-array 和 microfluidic-droplet。
各有其优缺点，这里只做简单介绍，感兴趣的小伙伴可以去Google一下具体差异。
1️⃣ Microtitre-plate
- 优点是建库之前可以对细胞进行观察，识别并丢弃受损的细胞等。
- 缺点是低通量。
2️⃣ Microfluidic-array
- 优点是通量比Microtitre-plate通量高，省试剂????。
- 缺点是不适合稀有细胞的处理。
- 这里提醒大家要注意一下
arrays的nanowells大小问题。
3️⃣ Microfluidic-droplet
- 优点是高通量，低成本。????
-
缺点当然也是低成本带来的啦????，一般
coverage都比较低，往往检测深度就不够了，transcripts比较少。
Tips! 如果用FACS分离细胞的话，可以染一下live/dead, 避免一些活力低的细胞影响结果。????
最后祝大家早日不卷!~