STOmics-seq：立体视图教程 (I)
一、背景介绍
大家其实对华大测序的原理什么的都知道，但是以下概念是比较重要的，什么是DNB，bin，我们怎么选择binsize的大小等问题就至关重要了。
首先解释以下DNB和bin的关系，以下来自华大的结题报告：
在华大的时空组学技术（STOmics）中，Bin是分析数据统计的基本单元。一个Bin表示一个固定大小的区域，区域内 DNB 表达量累加，区域间不重合，数字表示单边 DNB 数量。时空芯片上每个 DNB 在基因表达热图上表现为一个像素点，此时的分析单元为Bin1，即一个像素点只包含一个 DNB 的数据，其分辨率为500nm。将相邻N×N个 DNB 数据合并，在基因表达热图上以一个像素点的形式展示，此时分析单元为BinN。比如Bin100表示一个分析单元包含100×100=10000个 DNB 区域的数据，而cellbin是根据ssDNA进行细胞分割后的单个细胞的区域。Bin大小的选择可以根据细胞大小、基因数量以及细胞聚类效果进行调整。
常见的名称：
- BinSize：合并作为一个单元进行分析的DNB数量；
- MeanGeneTypes：所有Bin中捕获到基因类型的平均数；
- MedianGeneTypes：所有Bin中捕获到基因类型的中位数；
- MeanMIDs：所有Bin中表征基因表达量的MID平均数；
- MedianMIDs：所有Bin中表征基因表达量的MID中位数。
简而言之，bin1=DNB=500nm大小的区域。如果是bin100就是50um×50um的范围（um应该是错误写法，输入法不好打）。那我们分析的时候应该使用什么分辨率去分析呢？
我们应该考虑以下问题（个人愚见，不对的地方欢迎指教）：
1、组织的细胞大小，500nm已经是亚细胞级了，我们更想在单细胞水平去探索组织的基因表达等问题，那么不同组织就要用不同的binsize去获得单细胞水平的表达量。
2、基因数量，虽然我们能根据细胞大家确认binsize，但是过小的size会导致单位内的基因检测数过低，在实际分析中并不理想，因此要保证基因检测数的条件下通常选取的size是大于细胞的实际大小。常用的10X的空间技术的一个spot点实际上也是多个细胞构成。
3、根据细胞聚类效果进行调整，由于binsize选择不合适的大小会导致细胞聚类的结果和实际情况不符，那么就需要调整合适的size大小，比如华大在研究斑马鱼的胚胎发育，选取的是bin15进行分析的。
记住这里的binsize的设置，后续stereopy分析时需要设置。
二、stereopy的数据来源和安装
stereopy使用的是 GEF 文件文件，这个10X的文件截然不同。这个数据是数据下机后使用STOmics/SAW (github.com)，华大自主研发，与数据配套的软件，这里可以类比为spaceranger，可以获得表达矩阵和空间位置的软件。具体使用方法，见链接。这里不进行记录，因为华大一般是提gef文件，这一步分析不需要我们进行。当然如果您是特殊物种，可能需要构建参考基因组后自行分析，那需要好好学习以下SAW的使用。我有空再进行学习。
下面展示stereopy的安装，推荐使用conda进行安装
#使用python3.8的版本，此环境命名为st，也可根据习惯自行命名
conda create --name st python=3.8
#激活进入st环境
conda activate st
#安装stereopy 和对应的依赖包
conda install stereopy -c stereopy -c grst -c numba -c conda-forge -c bioconda
#也可以进入conda环境后使用pip安装
pip install stereopy
三、stereopy与其他软件的格式相互转换
目前主流的分析软件还是seurat或Scanpy，即使stereopy已经具体这些功能，但是下游的高级分析的数据大多还是使用rds或者h5ad格式，那么数据格式转换是必不可少的。下面就展示以下数据的读入和转换的脚本。
1、转换为h5ad后使用 Scanpy
import stereo as st
import warnings
warnings.filterwarnings('ignore')
# read the GEF file
data_path = 'sample.tissue.gef'
data = st.io.read_gef(file_path=data_path, bin_size=50)#bin_size设置binsize的大小
data.tl.raw_checkpoint()
# remember to set flavor as scanpy
adata = st.io.stereo_to_anndata(data,flavor='scanpy',output='scanpy_out.h5ad')
2、转换为rds后使用Seurat
转换为rds之前还是需要先输出为H5ad格式
import stereo as st
import warnings
warnings.filterwarnings('ignore')
# read the GEF file
data_path = '.sample.tissue.gef'
data = st.io.read_gef(file_path=data_path, bin_size=50)
data.tl.raw_checkpoint()
# remember to set flavor as seurat
adata = st.io.stereo_to_anndata(data,flavor='seurat',output='seurat_out.h5ad')
然后将h5ad转换为rds：
Rscript annh5ad2rds.R --infile <h5ad file> --outfile <rds file>
annh5ad2rds.R的链接：
Stereopy/docs/source/_static/annh5ad2rds.R at dev · STOmics/Stereopy · GitHub
四、小结
如果有空间的分析经验，通过以上的转换即可，择自己习惯的scanpy或者seurat进行分析。如果binsize设置的小，spot点较多，推荐使用scanpy，python处理大数据方面比R包的seurat要有优势。那么stereopy后续的内容也可以不必学习。后续我还会继续学习sterepy的具体使用方法。
以上是我个人学习心得，如有错误请指正。