【卡梅德生物】详解基因编辑技术点滴

        作为研究最为深入的基因编辑CRISPR/Cas技术，主要包括sgRNA（single-guide RNA）和Cas9蛋白两个作用元件，可以实现基因定点的精确编辑。sgRNA引导Cas9蛋白识别基因组特定位点，精确剪切待编辑的生物体基因组，导致双链断裂（DSB, double strand break），生物体随后利用非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）对双链断裂进行修复。

CRISPR-Cas9的基因编辑方法：

与基于核酸内切酶另外两代基因编辑技术类似，CRISRP/Cas9基因编辑技术主要分为两个过程。首先，Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，使得DNA双链断裂；然后，生物体内的DNA修复系统修复双链断裂，在修复的过程中实现DNA序列的改变。

DNA修复机制分为两类：同源重组 (HDR) 和非同源末端连接 (NHEJ)。同源重组修复需要借助外源的修复模板，可以实现精确可控的编辑（例如精准的基因插入和替换）；NHEJ修复不依赖修复模板，直接将两个DNA末端拼接，但在拼接的过程中会产生碱基插入或缺失 (indels)，无法实现精确的编辑，非同源末端连接是一种易错易突变的修复途径，容易导致断裂位点插入或缺失数个碱基，从而引起目标基因移码突变或提前终止。

随着研究的深入，CRISPR/Cas技术已经被广泛的应用。除了基因敲除，基因替换等基础编辑方式，它还可以被用于基因激活，疾病模型构建，甚至是基因治疗。如图展示了最基础的两种CRISPR/Cas9技术应用。

图1 CRISPR-Cas9技术应用

CRISPR-Cas9基因敲除系统（knock out）原理：

CRISPR-Cas9基因敲除系统是Cas9内切酶切割双链DNA，生物体启动NHEJ修复途径，切割位点产生移码突变，导致基因沉默。首先在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，DNA断裂处插入或缺失几个碱基，然后双链DNA的切割末端连接在一起，从而实现了细胞中目标基因的敲除。这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因

CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）原理：

CRISPR-Cas9基因敲入系统：Cas9内切酶切割双链DNA，同时DNA修复模板质粒（供体DNA分子）存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。HDR机制可以通过同源重组将一段DNA序列插入切割位点。这种修复方式可以将一段外源的DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

图2基因敲入原理图

CRISPR-Cas9基因敲除系统（knock out）流程：

（1）设计sgRNA

涉及sgRNA后，进行软件分析预测，sgRNA没有脱靶结合位点。

（2）构建sgRNA-Cas9载体

（3）构建sgRNA-Cas9稳转株

利用慢virus包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株，进行嘌呤筛选

（4）筛细胞克隆并进行qPCR验证

嘌呤霉素筛选后分离阳性克隆。提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑

（5）阳性克隆测序，选择敲除纯合细胞株

通过Sanger测序进一步分析阳性克隆的PCR产物以确定敲除的性质

（6）筛选细胞单克隆测序

通过有限稀释法选择阳性单克隆。提取基因组DNA，进行PCR扩增，克隆和测序。

（7）进一步测序，确定纯合突变

CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）流程：

实验流程

（1）设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

设计了sgRNA进行软件分析，预测设计的sgRNA没有脱靶结合位点。同时合成DNA修复模版，两侧同源臂，两侧各有600bp的同源臂。

（2）构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到载体上。将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的表达载体。

（3）将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转工具细胞

选择合适的转染试剂将上述两种质粒转染工具细胞。

（4）嘌呤筛选，检测荧光

（5）PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入