祝贺胡鹏、邱琪与吴昊团队！成功研发一种能一次性识别单个细胞中DNA 5hmC和5mC修饰的新一代测序技术 - Nat Biotechnol 来报道

DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是一种重要的表观遗传修饰，参与了细胞特异的基因表达调控、基因组稳定性维持等重要的过程。哺乳动物细胞中，DNA胞嘧啶甲基化可以被TET家族蛋白氧化，进而去甲基化，从而动态调控基因组中的胞嘧啶修饰（ 图1a, b）【1】。胞嘧啶羟甲基化修饰（5hmC）是基因组中丰度最高的去甲基化中间产物（尤其在神经细胞中），可能发挥着重要的功能【2】。但是由于传统的亚硫酸盐测序技术（Bisulfite sequencing）无法区分5mC 和5hmC修饰（图1c），研究团队在2018年研发了ACE-seq技术能在单碱基分辨率上鉴定5hmC修饰【3】，然而如何在单细胞水平对这两种DNA修饰进行定量检测还是一个挑战。

图1 DNA 胞嘧啶甲基化的动态调控和基于测序的检测技术【1,2】。

2023年8月28日，宾夕法尼亚大学吴昊实验室在Nature Biotechnology杂志在线发表了研究论文 Joint single-cell profiling resolves 5mC and 5hmC and reveals their distinct gene regulatory effects ，报道了一种同时检测基因组DNA 5hmC和5mC修饰的单细胞测序新技术, Joint-snhmC-seq（全称Joint single-nucleus (hydroxy)methylcytosine sequencing）。

这项技术的核心是通过化学脱氨和APOBEC3A (A3A) 酶促脱氨两个步骤（图2a），将未修饰的胞嘧啶 (C) 和甲基化修饰的胞嘧啶（5mC）分别转化为尿嘧啶（U）或胸腺嘧啶（T），并在最终的测序结果中转化为胸腺嘧啶（T）；而5hmC修饰位点不被脱氨基，在测序结果中仍然保持胞嘧啶状态（C）。研究团队首先将酶促脱氨的步骤加入到snmC-seq建库流程中【4】，开发了检测单细胞内5hmC位点的snhmC-seq技术（图2a）。通过系统的优化脱氨反应条件和文库构建的关键步骤，作者提高了检测的灵敏度和稳定性（snhmC-seq2技术），进一步开发出同时检测5mC和5hmC的Joint-snhmC-seq技术（图2b）。应用Joint-snhmC-seq技术，作者测定了小鼠大脑皮层中不同细胞类型的5hmC和 真实5mC修饰水平，并进一步研究了这两种修饰与基因转录水平的关系，发现某些细胞类型特异表达的长基因意外的倾向于维持较高的基因区（gene body）5mC水平并保持活跃的转录状态。

图2 snhmC-seq和Joint-snhmC-seq的流程图。

为了评估Joint-snhmC-seq技术细胞聚类结果的准确性，作者先应用了免疫荧光辅助的细胞核分选技术，将小鼠大脑皮层细胞核分为非神经细胞（NeuN-）、抑制性神经元（NeuN+ & Neurod6-）和兴奋性神经元（NeuN+ & Neurod6+），再对收集的细胞核进行Joint-snhmC-seq分析。利用单细胞核CG甲基化的相似性进行聚类，作者鉴定到6种细胞类型，并且聚类结果与细胞核分选结果高度一致。进一步，作者对Joint-snhmC-seq数据两个模块进行联合分析，从而对不同细胞类型中的胞嘧啶（unmodified C）、5mC和5hmC水平的定量分析。与前人研究一致，3种神经元细胞中5hmC水平(23.8-29.4%)显著高于3种非神经细胞。同时，作者还发现了尚未报道的现象：不同非神经细胞之间5hmC水平存在着明显差异 [星形胶质细胞 (Astrocytes), 12.7%; 小胶质细胞(Microglia), 3.58%]。

作者利用单细胞核CH甲基化的相似性对神经元细胞进行再次聚类，进一步鉴定到8种细胞亚型，并对这些细胞亚型中的5mC和5hmC水平进行了定量分析。

综上，Joint-snhmC-seq是一种能在单细胞水平准确定量DNA胞嘧啶5mC和5hmC修饰的新技术。与已有的5hmC测序技术相比【5,6】，这项新技术具有低样品起始量，高准确度，和同时检测两种修饰等优势。预期这一技术将用于研究5mC和5hmC修饰在脑发育与成熟、疾病形成相关过程的作用等重要生物学问题。

宾夕法尼亚大学吴昊教授为通讯作者，Emily Fabyanic博士（已毕业）、胡鹏博士（目前任上海海洋大学水产与生命学院教授）和邱琦博士为共同第一作者。Emily Fabyanic和邱琦博士建立和优化了Joint-snhmC-seq文库构建方法，胡鹏博士开发了Joint-snhmC-seq数据分析流程。宾夕法尼亚大学的Zhaolan Zhou实验室和 Rahul Kohli实验室也对研究做出了重要贡献。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01909-2

制版人：十一

参考文献

1. Kohli, R. & Zhang, Y. TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation. Nature 502, 472–479 (2013).

2. Wei, A. & Wu, H. Mammalian DNA methylome dynamics: mechanisms, functions and new frontiers.Development 149, dev182683 (2022).

3. Schutsky, E.K. et al. Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat Biotechnol 36, 1083-1090 (2018).

4. Luo, C. et al. Single-cell methylomes identify neuronal subtypes and regulatory elements in mammalian cortex. Science 357, 600–604 (2017).

5. Yu, M. et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell 149, 1368–1380 (2012).

6. Booth, M. J. et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science 336, 934–937 (2012).