单细胞测序揭示不同环境中中性粒细胞的异质性

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文章题目：Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection 期刊：Nature Immunology 日期：2020年7月 DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-020-0736-z

摘要

研究者主要使用单细胞测序分析了超过25000个分化和成熟的小鼠中性粒细胞，提供中性粒细胞在稳态和细菌感染期间成熟、功能和命运决定的综合转录图谱。鉴定出8个亚群，3个成熟的外周血中性粒细胞亚群来自不同的成熟骨髓中性粒细胞亚群。在已知和未表征的转录因子的驱动下，中性粒细胞逐渐获得杀死微生物能力，代表了一种对有效但平衡的中性粒细胞反应进行微调调节的进化机制。细菌感染对中性粒细胞群的遗传结构进行重新编程，改变亚群之间的动态转变，并在不影响整体异质性的情况下启动中性粒细胞以增强功能。总之，这些数据为在单细胞分辨率下研究中性粒细胞相关疾病机制、生物标志物和治疗靶点建立了参考模型和一般框架。

实验结果

稳态环境下的中性粒细胞异质性

图a，整个流程示意图。

实验对象：使用FACS 分选 小鼠骨髓、外周血、脾脏 中的 Gr1+ 细胞。【作者额外准备了个样本做批次效应校准：c-Kit+ 骨髓造血干细胞 ：BM Gr1+ 细胞=2:3 混入】

质控后数据：19582个细胞，每个细胞测到1241个基因，共计测到18269个基因，降维、聚类分群如下图b,c。

G0-G4是来自于骨髓，G5a-c 来自于外周组织。不同群的基因表达不太相同（图d）。为了确保数据的准确性，研究者将测序数据与已经发表的数据merge比对，一致性很高，本研究测得基因量甚至更多。本研究发现了2922个DEGs和24个signature genes（图e），在中性粒细胞成熟的早期过程中，基因富集都与细胞周期有关（图f）。

Fig1 单细胞测下稳态环境下 骨髓、外周血、脾脏来源的中性粒细胞

中性粒细胞的分化和成熟轨迹

使用monocle 计算了不同亚群之间的分化轨迹。轨迹图上，从 BM 中的 G1 细胞开始，以 PB 和脾脏中的 G5 细胞结束（图 1h）。G1 到G2 细胞经历了活跃的增殖，细胞分裂突然停止 （图1i）。一部分 G3 细胞跟随 G2 扩增并表达次级颗粒基因，如 Ltf、Camp 和 Ngp（图 1e）。骨髓 中的中性粒细胞分化以更成熟的 G4 群体高度表达 Mmp8（编码中性粒细胞介导的宿主防御的关键颗粒蛋白）和 Cxcl2 结束，这对中性粒细胞移动很重要（图 1d，e）。G5细胞占外周组织中性粒细胞的大部分，是最成熟的中性粒细胞，而G4细胞表现出最高的成熟度。

区分中性粒细胞颗粒性异质性的机制

检测分化的中性粒细胞，已知的颗粒基因表达情况（下图a-c）。LTF+ 颗粒通常被定义为第二颗粒。

单细胞测序与形态学相关

已知中性粒细胞的形态上的分化分为五个阶段：成髓细胞; 早幼粒细胞；髓细胞; 骨髓细胞和分段中性粒细胞。我们比较了 scRNA-seq 定义的中性粒细胞群体与经典的形态学定义的中性粒细胞[ 通过基于 c-Kit 和 Ly6G 表达的 FACS 分离24 和批量测序（图 2d）] . scRNA-seq 测得的大多数分子特征在 RNA-seq 数据中也检测到（上图 2e )。为了进一步剖析形态异质性，基于回归的反卷积方法应用于普通转录组。成髓细胞是 G0 和 G1 的混合物，早幼粒细胞为 G1，粒细胞为 G1/G2，后幼粒细胞是 G2，条带细胞和分段的中性粒细胞是 G3/G4（上图 2f ）。

外周血、脾脏包括3种不同的中性粒细胞亚群

如上图2g，外周血、脾脏中有三个主要的中性粒细胞亚群。和G4 细胞类似，G5a高表达Mmp8 和S100a8，以及其他细胞迁移、炎性反应相关基因（图2h）。轨迹分化分析表面 G5a，G5b发育成G5c（图2i，j）G5c的衰老打分更高。

实验分离细胞亚群

下图（图3）。按照图a所示流程，分出了外周血中的G0-G4。G4高表达CXCR2（图b）通过CXCR2区分G3,G4。骨髓中的G1-4的比例见图C。通过IFIT1分离出外周血种的G5b亚群（图3d）。G5c属于比较衰老的细胞，高表达CXCR4，也就是IFIT1−CXCR4hi细胞。G5a是IFIT1−CXCR4lo（图3d）。反向表征这三种细胞（图3ef），所占比例与单细胞测序数据中比较一致（图3g）

中性粒细胞移动过程中的复杂性

下图，图4. 作者做了RNA velocity。与monocle的结果相一致，G2到G4有单个遵循单个主线而没有分叉，G3有强烈进化为G4的可能性。G5c在成熟和分化的末端，有着很高的调往比例（图4c），凋亡程序可能和成熟程序无关。G3和G4亚群都是存在BM中的主要分化中的中性粒细胞。PB的G3可以直接分化成G5a而不用通过G4（图4d），外周血、脾脏中的G4比较少.

一些比较重要的转录因子

接着找了一些在分化、成熟的过程中比较重要的转录因子（图4e）。Gata2, Irf8和Runx1,高表达在G0群。G1群高表达Gfi1 和Cepba。作者做了个SCENIC分析（图4f）。Seurat 的亚群和SCENIC的亚群高度一致（图4g）。作者还分别比较了中性粒细胞亚群和其他非中性粒细胞群的regulon活性，得到了19个 中心粒细胞特异性的网路（图4h），包括已知的Cebpe，Spi1，Klf5，和新发现的Nfil3，Max，Mlx和Xbp1（图4i）。接着又看了在连续分化的过程中一些调节活性的变化（图4j）。结果显示至少有五个调节子具有不同激活模式的组，包括两个早期激活的，一种晚激活，一种全局激活，一种在 G2 后特异性失活。虽然许多转录因子网络，包括Cebpe、Ets1、Klf5、Rad21 和 E2f2 等对中性粒细胞有贡献承诺，Xbp1 和 Mlx 网络的变化是特别的与 G0/G1 转换相关。此外，E2f1、Nelfe 和 Rb1 等的显著降低表明G2 和 G3可能有着功能的变化。

细菌感染不影响异质性

下图图5. 主要检测细菌感染会不会影响中性粒细胞亚群。结果发现Ecoli处理组并不影响核心signature 基因的表达（图5a,b,c)。但是细菌感染造成每个亚群内部的基因表达差异（图5d）。G0，G1亚群差异表达的基因主要富集在调节免疫小因子和ROS代谢（图5e）。细菌感染诱导相对成熟的G4，G5亚群细胞因子分泌下调（图5e）。在细菌感染的宿主中，杀菌活性相关的中性粒细胞功能包括颗粒蛋白的合成（图 5f）、NADPH 氧化酶复合物（图 5g）、吞噬作用和趋化性（图 5h）表达都被上调。

细菌感染后ISG相关的G5b细胞群在人和小鼠体内都有增殖现象

下图图6.在G5b在伤口感染的时候，细胞群占比显著增高。表明G5b在感染过程中发挥作用。作者使用S100a和IFIT1 抗体标记G5b细胞。在正常条件下，S100a8+ 中性粒细胞均匀分布在红髓中，而 G5b (S100a8+IFIT1+) 细胞则优先位于包膜下。Ecoli感染后，脾脏中的中性粒细胞总数显着增加，G5b 的百分比和数量也显着增加（图 6b），它们仍然优先位于荚膜下，它们的特殊位置进一步证明了该亚群的独特性。尽管在细菌刺激后，基本上所有中性粒细胞亚群中的多个 ISG（例如 Ifitm1）均上调（图 6c），但在 G5b 中特异性表达的许多 ISG，如 Isg15 和 Oas2 并未上调，表明 ISG-相关的 G5b 扩增不是由于细菌诱导的 ISG 表达。接下来，我们通过来自健康供体的分选的人类 PB 中性粒细胞的 scRNA-seq 检查了该 G5b 群体是否也存在于人类血液中。无监督聚类揭示了三个主要的中性粒细胞群体，其中一个是表达 ISG 的人类 G5b 群体（图 6d-f）

细菌感染加速G1群细胞分裂、有丝分裂后成熟而不改变细胞分化

下图图7.中性粒细胞分化和成熟轨迹在Ecoli攻击的小鼠中基本保持（图 7a）。细菌感染后中性粒细胞分化程序的整体稳定性也通过对照和细菌感染样本中 SCENIC 转录调控网络的相关性得到证明（图 7b）。虽然 G1 和 G2 细胞均增殖，但增殖评分仅在 G1 群体中增加（图 7c），与 G2/M 期进展相关的基因也是如此，而与 S 期进展相关的基因在急性感染期间的 G2 细胞（图 7d）降低。

G3 和 G4 细胞的比例在 E.coli 感染的宿主中骨髓里没有增加（图 5b），表明 骨髓里的有丝分裂后成熟可能会加速。为了验证这一假设，我们用 EdU标记分裂细胞，并在骨髓 和 外周血 中有丝分裂后跟踪这些细胞（图 7e）。基于 Ly6G 和 CXCR4 在分化中性粒细胞中的表面表达，我们分离了相对不成熟的 (Ly6GlowCXCR4hi)、中间成熟的 (Ly6GhiCXCR4high) 和成熟的中性粒细胞 (Ly6GhiCXCR4low)，并检查了这些 EdU 标记细胞中的出现不同时间点的亚群。在正常小鼠的骨髓中，EdU 标记的细胞在 2 小时后进入未成熟中性粒细胞阶段，12 小时后进入中间成熟阶段，并在 48 小时后成为成熟的中性粒细胞。每个阶段的持续时间约为24小时，72小时后EdU+细胞出现在外周血和脾脏中（图7f）。在Ecoli感染的宿主中，Ly6GhiCXCR4low 细胞的百分比显着降低，Ly6GlowCXCR4hi 和 Ly6GhiCXCR4hi 细胞在骨髓和外周血中占主要部分。这些中性粒细胞通过相似的模式移动到外周组织，但是时间更短，只有2天，而不是正常的3天（图7f）。

细菌感染重编程中性粒细胞的亚群结构和相互之间的动态转变

下图图8. 骨髓中G1细胞群在细菌感染后占比上升（图8a），G2不怎么变，G4从38%降到30%。Velocity分析能看到稳态环境下G3到G5a的转化（图8b）。外周血的G4来源于骨髓里的G3（图8b）.表明不同来源的中性粒细胞之间有一定的联系。进一步确定感染位点的中性粒细胞异质性。提取了发炎覆膜腔的中性粒细胞（图8c，d）。外周血中性粒细胞中，感染前，G5c细胞只占25%，感染后只占10%。但是发炎覆膜腔的G5c中性粒细胞占比45%（图8d），表明这些细胞具有更高的transendothelial 的迁移能力。比较奇怪的是，细菌感染后，与细胞凋亡、坏死相关的基因在所有亚群中都表达上调（图8e），表明受感染宿主的中性粒细胞延迟死亡主要是由凋亡因子和通路的激活决定的，而不是由相关蛋白质的水平决定的。

总结

作者主要做了不同组织来源的中性粒细胞的单细胞转录组测序，对比感染前后的变化。作者还将自己的数据和已报道的中性粒细胞亚群做了详细比较，在补充文件中有展示，感兴趣的可以查阅。