单细胞免疫组化库 VDJ - CellRanger 结果解读（III）
最编程
2024-03-02 13:56:20
...
一、outs目录概括
以下是10X官方给出的一个典型的vdj运行后的output 目录：
$ cd /home/jdoe/runs
$ cellranger vdj --id=sample345 \
--reference=/opt/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0 \
--fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
--sample=mysample \
Martian Runtime - v4.0.6
Running preflight checks (please wait)...
yyyy-mm-dd hh:mm:ss [runtime] (ready) ID.sample345.SC_VDJ_ASSEMBLER_CS.VDJ_PREFLIGHT
yyyy-mm-dd hh:mm:ss [runtime] (run:local) ID.sample345.SC_VDJ_ASSEMBLER_CS.VDJ_PREFLIGHT.fork0.chnk0.main
yyyy-mm-dd hh:mm:ss [runtime] (ready) ID.sample345.SC_VDJ_ASSEMBLER_CS.VDJ_PREFLIGHT_LOCAL
...
Outputs:
- Run summary HTML: /home/jdoe/runs/sample345/outs/web_summary.html
- Run summary CSV: /home/jdoe/runs/sample345/outs/metrics_summary.csv
- Clonotype info: /home/jdoe/runs/sample345/outs/clonotypes.csv
- Filtered contig sequences FASTA: /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_contig.fasta
- Filtered contig sequences FASTQ: /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_contig.fastq
- Filtered contigs (CSV): /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_contig_annotations.csv
- All-contig FASTA: /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.fasta
- All-contig FASTA index: /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.fasta.fai
- All-contig FASTQ: /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.fastq
- Read-contig alignments: /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.bam
- Read-contig alignment index: /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.bam.bai
- All contig annotations (JSON): /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig_annotations.json
- All contig annotations (BED): /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig_annotations.bed
- All contig annotations (CSV): /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig_annotations.csv
- Barcodes that are declared to be targetted cells: /home/jdoe/runs/sample345/outs/cell_barcodes.json
- Clonotype consensus FASTA: /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.fasta
- Clonotype consensus FASTA index: /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.fasta.fai
- Contig-consensus alignments: /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.bam
- Contig-consensus alignment index: /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.bam.bai
- Clonotype consensus annotations (CSV): /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus_annotations.csv
- Concatenated reference sequences: /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.fasta
- Concatenated reference index: /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.fasta.fai
- Contig-reference alignments: /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.bam
- Contig-reference alignment index: /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.bam.bai
- Loupe V(D)J Browser file: /home/jdoe/runs/sample345/outs/vloupe.vloupe
- V(D)J reference:
fasta:
regions: /home/jdoe/runs/sample345/outs/vdj_reference/fasta/regions.fa
donor_regions: /home/jdoe/runs/sample345/outs/vdj_reference/fasta/donor_regions.fa
reference: /home/jdoe/runs/sample345/outs/vdj_reference/reference.json
- AIRR Rearrangement TSV: /home/jdoe/runs/sample345/outs/airr_rearrangement.tsv
- All contig info (ProtoBuf format): /home/jdoe/runs/sample345/outs/vdj_contig_info.pb
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二、web_summary.html
文件web_summary.html汇总分析结果。如果在运行期间检测到问题，此页面上会显示warning或error 。
- Reads Mapped to Any V(D)J Gene：比例越高，效果越好，一般大于60%，如果这个值比较低，可能是PCR扩增环节的循环数不够。
-
V(D)J Expression：这部分值取决于样本，通常能观察到TRB基因的表达大于TRA，Ig通常比TCR表达量高。
image.png -
Paired Clonotype Diversity：可评估样本中的克隆多样性，如果该值为1，那么代表样本中只有1中克隆型存在
image.png -
Fraction Reads in Cells：与细胞相关的barcodes 的所有reads pairs数除以所有的有效barcodes 的reads pairs数，这个值越高，代表样本质量越好。
cell calling结果 - Number of Reads：原始数据的reads pairs的数量。
- Valid Barcodes：和软件白名单barcode序列一致或只有1个碱基差别的reads百分比。
-
Q30 Bases in Barcode：被识别为细胞的reads的测序不同区段高质量测序的百分比。
image.png
三、表格结果
1、Clonotype CSV File (clonotypes.csv)
| Column | Description |
|---|---|
| clonotype_id | 克隆型的 ID，按照1,2,3依次排列。 |
| frequency | 在细胞中检查出的克隆型数量，侧面部分反映了克隆型的丰度。 |
| proportion | 表达克隆型的细胞数占样本细胞总数的比例。 |
| cdr3s_aa | CDR3 氨基酸序列。 |
| cdr3s_nt | CDR3 核苷酸序列。 |
| inkt_evidence | 对于 T 细胞，此列将包含该克隆型是一组 iNKT 细胞的证据（没有则为空白）。 证据是分号分隔的chain:matches列表，其中chain 是TRA 或TRB 之一，matches 是genes、junction 或genes+junction 之一。 有关详细信息，请参阅 iNKT/MAIT。 |
| mait_evidence | 对于 T 细胞，此列将包含该克隆型是一组 MAIT 细胞的证据（如果有）。 证据是分号分隔的chain:matches列表，其中chain 是TRA 或TRB 之一，matches 是genes、junction 或genes+junction 之一。 有关详细信息，请参阅 iNKT/MAIT。 |
2、Contig Annotation CSV Files (*contig_annotations.csv)
| Column | Description |
|---|---|
| barcode | barcode名称 |
| is_cell | 此barcode是否是一个细胞，True 或 False |
| contig_id | contig 的唯一标识符. |
| high_confidence | True 或 False，指contig是否被高置信度。 |
| length | contig 核苷酸的长度. |
| chain | 与 contig 关联的链； 例如，TRA、TRB、IGK、IGL 或IGH。 “Multi”值表示存在来自多个链的片段 |
| v_gene | 得分最高的 V 区 |
| d_gene | 得分最高的 D 区 |
| j_gene | 得分最高的 J 区 |
| c_gene | 得分最高的 C 区 |
| full_length | contig 是否是全长 |
| productive | contig 是否是 productive |
| fwr1 | 预测的 FWR1 氨基酸序列 |
| fwr1_nt | 预测的 FWR1 核苷酸序列 |
| cdr1 | 预测的 CDR1 氨基酸序列 |
| cdr1_nt | 预测的 CDR1 核苷酸序列 |
| fwr2 | 预测的 FWR2 氨基酸序列 |
| fwr2_nt | 预测的 FWR2 核苷酸序列 |
| cdr2 | 预测的 CDR2 氨基酸序列 |
| cdr2_nt | 预测的 CDR2 核苷酸序列 |
| fwr3 | 预测的 FWR3 氨基酸序列。 |
| fwr3_nt | 预测的 FWR3 核苷酸序列。 |
| cdr3 | 预测的 CDR3 氨基酸序列。 |
| cdr3_nt | 预测的 CDR3 核苷酸序列。 |
| fwr4 | 预测的 FWR4 氨基酸序列。 |
| fwr4_nt | 预测的 FWR4 核苷酸序列。 |
| reads | 与此 contig 对齐的reads数。 |
| umis | 与此 contig 对齐的不同 UMI 的数量。 |
| raw_clonotype_id | 分配此细胞barcode的克隆型的 ID。 |
| raw_consensus_id | 此 contig 分配到的一致性序列序列的 ID。 |
| exact_subclonotype_id | 分配此细胞barcode的确切亚克隆类型的 ID。 |
3、Consensus Annotation CSV Files (consensus_annotations.csv)
| Column | Description |
|---|---|
| clonotype_id | 克隆型的 ID |
| consensus_id | 一致性序列序列的 ID |
| v_start | 一致性序列上 V 区起始位置 |
| v_end | 一致性序列上 V 区末端位置 |
| v_end_ref | 参考上 V 基因末端位置 |
| j_start | 一致性序列上 J 区起始位置 |
| j_start_ref | 参考上 J 基因起始位置 |
| j_end | 一致性序列上 J 区末端位置 |
| cdr3_start | 一致性序列上 CDR3 区域起始位置 |
| cdr3_end | 一致性序列上 CDR3 区域末端位置 |
4、AIRR Rearrangements TSV File (airr_rearrangement.tsv)
| Column | Description |
|---|---|
| cell_id | Cell barcode 序列 |
| clone_id | Clonotype ID. |
| rev_comp | Set to false by default (10x Genomics VDJ sequences are not reverse complemented). |
| sequence_id | 与重排相关的contig的id |
| sequence | 重排的核苷酸序列 |
| sequence_aa | 重排的氨基酸序列 |
| productive | 重新排列是否有效 |
| v_call | 用于重排的对齐 V 基因的名称 |
| v_cigar | V 基因比对CIGAR string |
| v_sequence_start | V 区域起始位置的 contig |
| v_sequence_end | V 区域结束位置的 contig |
| d_call | 用于重排的对齐 D 基因的名称 |
| d_cigar | D基因比对的CIGAR string |
| d_sequence_start | D 区域起始位置的 contig |
| d_sequence_end | D 区域结束位置的 contig |
| j_call | 用于重排的对齐 J 基因的名称 |
| j_cigar | J基因比对的 CIGAR string |
| j_sequence_start | J 区域起始位置的 contig |
| j_sequence_end | J 区域末端位置的 contig |
| c_call | 用于重排的对齐 C基因的名称 |
| c_cigar | The CIGAR string of the C gene alignment. |
| c_sequence_start | 1-based index on the contig of the C region start position. |
| c_sequence_end | 1-based index on the contig of the C region end position. |
| sequence_alignment | The aligned sequence of the VDJ rearrangement. |
| germline_alignment | The assembled, aligned, full-length inferred germline sequence of the aligned sequence. |
| junction | The nucleotide sequence of the rearrangement's junction (CDR3). |
| junction_aa | 重排junction (CDR3) 的氨基酸序列 |
| duplicate_count | 与此重排相关的 unique molecular 的数量 |
| consensus_count | 与此重排相关的reads数 |
| junction_length | 重排的连接核苷酸序列的长度 |
| junction_aa_length | 重排的连接氨基酸序列的长度 |
| is_cell | Is this rearrangement cell-associated? |
参考：
官方结果文件说明
Understanding V(D)J Output